人角膜成纖維分離自眼角膜組織；角膜位于眼球前壁的一層透明膜，約占纖維膜的前1/6，從后面看角膜呈正圓形，從前面看為橫橢圓形。角膜厚度各部分不盡相同，中央部最薄。角膜有十分敏感的神經(jīng)末梢，如有外物接觸角膜，眼瞼便會不由自主地合上以保護眼睛。為了保持透明，角膜并沒有血管，透過外界空氣、淚液及房水獲取養(yǎng)份及氧氣。角膜分為五層，由前向后依次為：上皮細胞層、前彈力層、基質層、后彈力層、內皮細胞層。成纖維細胞（Fibroblast）是疏松結締組織的主要細胞成分，由胚胎時期的間充質細胞分化而來。成纖維細胞較大，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構，其細胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯。成纖維細胞功能活動旺盛，細胞質嗜弱堿性，具明顯的蛋白質合成和分泌活動，在一定條件下，它可以實現(xiàn)跟纖維細胞的互相轉化；成纖維細胞對不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損的修復有著十分重要的作用。剛分離的角膜成纖維細胞呈圓形、折光性良好，懸浮于培養(yǎng)基中。30min細胞貼壁，其中部分開始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起；6h后細胞基本貼壁wan全，伸展成梭形，胞核清晰，分布較均勻，散在生長，不聚集成團；細胞生長迅速，5-7天即呈融合狀態(tài)，細胞排列緊密，有的交叉重疊生長，平坦、胞體較大，細胞質透明，細胞核較大，呈橢圓形，顏色淡。細胞融合，并彼此連接成網(wǎng)狀；細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。角膜成纖維細胞在生理條件下的主要功能包括：構造和維持角膜的正常形態(tài)，合成和釋放細胞外基質以及組織損傷后及時大量聚集修復損傷組織。
方法簡介：

公司實驗室分離的人角膜成纖維采用yi蛋白酶-膠原酶混合消化法結合差速貼壁法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。
質量檢測：

公司實驗室分離的人角膜成纖維經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

本公司所有產(chǎn)品僅供科學實驗，不做其他科學實驗外的使用！

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 成纖維細胞樣

傳代特性 可傳5代左右；3代以內狀態(tài)

消化液 0.25%yi蛋白酶

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

準備工作

1. 實驗器材準備：準備無菌的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、移液管、離心管、手術器械等，并進行高壓滅菌或其他合適的消毒處理。

2. 試劑準備：配制或購買合適的培養(yǎng)基、消化酶（如、膠原酶等）、胎牛血清、雙抗等試劑，確保其無菌且在有效期內。

3. 實驗動物或組織來源準備：根據(jù)實驗需求，選擇合適的動物并進行相應的麻醉或處死，獲取所需組織；或從已有的組織樣本庫中獲取組織。

取材與處理

1. 取材：在無菌條件下，迅速取出目標組織，盡量減少對組織的損傷，并去除多余的脂肪、結締組織等非目的組織。

2. 清洗：將取出的組織用預冷的無菌PBS沖洗數(shù)次，以去除血液和雜質。

3. 剪切：將組織剪成約1 - 2mm3的小塊，以便后續(xù)消化。

細胞分離

1. 消化：將剪碎的組織塊放入含有適量消化酶的離心管中，在37℃恒溫搖床或培養(yǎng)箱中消化一段時間。期間可輕輕搖晃離心管，使消化更均勻。

2. 終止消化：當組織塊大部分被消化成單細胞懸液或小細胞團時，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。

3. 過濾與離心：用細胞篩過濾細胞懸液，去除未消化的組織碎片，然后將濾液以適當?shù)霓D速離心，收集細胞沉淀。

細胞觀察與檢測

1. 日常觀察：每天用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)、密度等，記錄細胞的變化情況，如發(fā)現(xiàn)細胞污染或異常，及時采取相應措施。
2. 細胞計數(shù)與活力檢測：在需要時，可采用臺盼藍染色等方法對細胞進行計數(shù)和活力檢測，以了解細胞的生長情況和健康狀態(tài)。

一、取材與分離

1. 快速操作

- 組織取材后需立即處理，避免長時間暴露于室溫或非營養(yǎng)環(huán)境。

- 使用無菌 PBS 或生理鹽水沖洗組織，去除血液、雜質。

2. 消化酶選擇

- 根據(jù)組織類型選擇消化酶，避免過度消化導致細胞損傷。

- 消化時間需嚴格控制（通常 10-30 分鐘），可通過顯微鏡觀察細胞解離狀態(tài)。

二、培養(yǎng)條件優(yōu)化

1. 培養(yǎng)基選擇

- 使用含血清或特定生長因子的培養(yǎng)基（如 DMEM、RPMI 1640 等），部分細胞需添加胰島素、EGF 等。

- 避免頻繁更換培養(yǎng)基品牌或批次，減少細胞適應壓力。

2. 貼壁與傳代

- 原代細胞貼壁能力較弱，可能需要包被培養(yǎng)皿（如膠原蛋白、多聚賴氨酸）。

- 傳代時密度建議控制在 70%-80%，過度匯合會導致接觸抑制和分化。

三、污染控制

1. 無菌操作

- 全程在超凈臺操作，使用一次性耗材，避免交叉污染。

- 培養(yǎng)基中可添加雙抗，但長期使用可能影響細胞活性。

2. 支原體檢測

- 定期檢測支原體污染（如 PCR 法），污染后需及時丟棄細胞。

四、狀態(tài)監(jiān)控

1. 日常觀察

- 每天檢查細胞形態(tài)、密度及培養(yǎng)基顏色，及時更換培養(yǎng)基（通常每 2-3 天換液一次）。

- 異常形態(tài)（如細胞變圓、碎片增多）可能提示污染或營養(yǎng)不足。

2. 傳代與凍存

- 原代細胞分裂次數(shù)有限（一般 5-10 代），需及時凍存早期代次細胞。

- 凍存液建議使用 DMSO+血清（或專用凍存培養(yǎng)基），梯度降溫后液氮保存。