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人肺小動脈平滑肌分離自肺小動脈組織；小動脈（smallartery），管徑在0.3～1mm之間，小動脈包括粗細不等的幾級分支，也屬肌性動脈。較大的小動脈，內(nèi)膜有明顯的內(nèi)彈性膜，中膜有幾層平滑肌，外膜厚度與中膜相近，一般沒有外彈性膜。小動脈是決定周圍循環(huán)阻力大小的主要因素，也是調(diào)節(jié)微循環(huán)灌注量的“總開關(guān)"。典型的小動脈，其管壁的厚度與管徑相比約為1∶2。中膜的肌層相對比其他動脈為厚，當(dāng)平滑肌在神經(jīng)支配下強力收縮時，其管腔可以wan全閉塞，而使血液不能流入它所分布的毛細血管內(nèi)，從而增加了周圍血液循環(huán)的阻力。如果有許多小動脈同時收縮，可使血壓顯著上升。反之，當(dāng)小動脈的平滑肌舒張時，則可使大量的血液流入毛細血管，外周阻力明顯下降，血壓降低。終末小動脈（terminal arteri-ole）的口徑為20～30μm；后小動脈（metar-teriole），又稱毛細血管前小動脈（precapil-lary arteriole）的口徑為12～15μm。管壁內(nèi)均有較稀疏的平滑肌，在毛細血管前小動脈分支的起始部分，管壁平滑肌成分增厚，叫做毛細血管前括約肌（precapillary sphinc-ter），其收縮或舒張，可調(diào)節(jié)真毛細血管的血流量，是調(diào)節(jié)微循環(huán)灌注量的“分開關(guān)"。
方法簡介：

公司實驗室分離的人肺小動脈平滑肌采用中性dan白酶-膠原酶聯(lián)合消化法制備而來制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測：

公司實驗室分離的人肺小動脈平滑肌經(jīng)α-SMA免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次；

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 成纖維細胞樣

傳代特性 可傳3-5代左右

消化液 0.25%yi蛋白酶

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

準(zhǔn)備工作

1. 實驗器材準(zhǔn)備：準(zhǔn)備無菌的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、移液管、離心管、手術(shù)器械等，并進行高壓滅菌或其他合適的消毒處理。

2. 試劑準(zhǔn)備：配制或購買合適的培養(yǎng)基、消化酶（如、膠原酶等）、胎牛血清、雙抗等試劑，確保其無菌且在有效期內(nèi)。

3. 實驗動物或組織來源準(zhǔn)備：根據(jù)實驗需求，選擇合適的動物并進行相應(yīng)的麻醉或處死，獲取所需組織；或從已有的組織樣本庫中獲取組織。

取材與處理

1. 取材：在無菌條件下，迅速取出目標(biāo)組織，盡量減少對組織的損傷，并去除多余的脂肪、結(jié)締組織等非目的組織。

2. 清洗：將取出的組織用預(yù)冷的無菌PBS沖洗數(shù)次，以去除血液和雜質(zhì)。

3. 剪切：將組織剪成約1 - 2mm3的小塊，以便后續(xù)消化。

細胞分離

1. 消化：將剪碎的組織塊放入含有適量消化酶的離心管中，在37℃恒溫搖床或培養(yǎng)箱中消化一段時間。期間可輕輕搖晃離心管，使消化更均勻。

2. 終止消化：當(dāng)組織塊大部分被消化成單細胞懸液或小細胞團時，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。

3. 過濾與離心：用細胞篩過濾細胞懸液，去除未消化的組織碎片，然后將濾液以適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速離心，收集細胞沉淀。

細胞觀察與檢測

1. 日常觀察：每天用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)、密度等，記錄細胞的變化情況，如發(fā)現(xiàn)細胞污染或異常，及時采取相應(yīng)措施。
2. 細胞計數(shù)與活力檢測：在需要時，可采用臺盼藍染色等方法對細胞進行計數(shù)和活力檢測，以了解細胞的生長情況和健康狀態(tài)。

一、取材與分離

1. 快速操作

- 組織取材后需立即處理，避免長時間暴露于室溫或非營養(yǎng)環(huán)境。

- 使用無菌 PBS 或生理鹽水沖洗組織，去除血液、雜質(zhì)。

2. 消化酶選擇

- 根據(jù)組織類型選擇消化酶，避免過度消化導(dǎo)致細胞損傷。

- 消化時間需嚴(yán)格控制（通常 10-30 分鐘），可通過顯微鏡觀察細胞解離狀態(tài)。

二、培養(yǎng)條件優(yōu)化

1. 培養(yǎng)基選擇

- 使用含血清或特定生長因子的培養(yǎng)基（如 DMEM、RPMI 1640 等），部分細胞需添加胰島素、EGF 等。

- 避免頻繁更換培養(yǎng)基品牌或批次，減少細胞適應(yīng)壓力。

2. 貼壁與傳代

- 原代細胞貼壁能力較弱，可能需要包被培養(yǎng)皿（如膠原蛋白、多聚賴氨酸）。

- 傳代時密度建議控制在 70%-80%，過度匯合會導(dǎo)致接觸抑制和分化。

三、污染控制

1. 無菌操作

- 全程在超凈臺操作，使用一次性耗材，避免交叉污染。

- 培養(yǎng)基中可添加雙抗，但長期使用可能影響細胞活性。

2. 支原體檢測

- 定期檢測支原體污染（如 PCR 法），污染后需及時丟棄細胞。

四、狀態(tài)監(jiān)控

1. 日常觀察

- 每天檢查細胞形態(tài)、密度及培養(yǎng)基顏色，及時更換培養(yǎng)基（通常每 2-3 天換液一次）。

- 異常形態(tài)（如細胞變圓、碎片增多）可能提示污染或營養(yǎng)不足。

2. 傳代與凍存

- 原代細胞分裂次數(shù)有限（一般 5-10 代），需及時凍存早期代次細胞。

- 凍存液建議使用 DMSO+血清（或?qū)Ｓ脙龃媾囵B(yǎng)基），梯度降溫后液氮保存。