TMB底物顯色試劑盒 Western Blot技術:

一、 原理

與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝#纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

二、分類TMB底物顯色試劑盒  現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用*種方法，目前發表文章通常是用底物化學發光ECL。只要買現成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。

三、 主要試劑

、 丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺，應以溫熱（以利于溶解雙丙稀酰胺）的去離子水配制含有29%（w/v）丙稀酰胺和%（w/v）N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺g，加H2O至 00ml。）儲于棕色瓶，4℃避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0，因可以發生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。 2、 十二烷基硫#鈉SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子水配制，室溫保存。

3、 分離膠緩沖液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合，加水稀釋到00ml終體積。過濾后40℃保存。

4、 濃縮膠緩沖液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml mol/L HCl調至pH6.8加水稀釋到00ml終體積。過濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調節PH值，而不用 Tris.CL。

5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化過硫#銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時，聚合反應受到抑制。0%（w/v）過硫#胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數ml，臨用前配制.

6、 SDS- PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍.6ml，H2O 32ml混勻備用。按:或:2比例與蛋白質樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量00μg。

7、 Tris-甘氨#電泳緩沖液:30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用蒸餾水溶解至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極緩沖液。臨用前稀釋0倍。

8、 轉移緩沖液：配制L轉移緩沖液，需稱取2.9g甘氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至總量L。

9、 麗春紅染液儲存液：麗春紅S 2g 三#乙#30g 磺基水楊# 30g 加水至00ml 用時上述儲存液稀釋0倍即成麗春紅S使用液。使用后應予以廢棄。

0、 脫脂奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮鈉（有毒，戴手套操作），溶于磷#緩沖鹽溶液（PBS）。

2、 Tris緩沖鹽溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗人-MMP-9（6）鼠抗人-TIMP-。

4、 過氧化物酶標記的第二抗體。

5、 NBT（溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶于00%二甲基甲酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L  做線粒體膜UCP2蛋白的Western Blot （以下簡寫成Western Blot），提取線粒體后凍存（未加蛋白酶抑制劑），樣品不能反復凍融;，加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗濃度。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，能多加幾中種蛋白酶抑制劑。
同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測，有的甚至可以同時測幾十種樣品。
如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，這時加上NaF去抑制磷#化酶的活性。
樣品的蛋白含量很低，每微升不到微克，但是在轉膜時經常會發現只有一部分蛋白轉到了膜上，就是在轉膜后染膠發現有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，可以加大上樣量，轉移時可以用減少電流延長時間，多加5-0%甲醇。
想分離的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度用6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的蛋白不好做
如果上樣量超載，可以濃縮樣品，也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30%是不會有問題的。如果已經超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試.5mm的 comb。
蛋白變性后存放-80℃，一兩年沒有問題，zui關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉;不要被細菌消化掉（也是被酶水解了）。
采用DAB顯色技術，二抗是化的多克隆抗體，三抗是親和素體系，不能使用脫脂奶粉，脫脂奶粉會影響親和素的生成，因為脫脂奶粉中含，用BSA代替應該好一點.
Western Blot一般上樣30-00微克不等，結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時間都有關系，也與顯色時間長短有關。開始摸條件時，為了拿到陽性結果，各個步驟都可以量多一點時間長一點，當然背景也就出來了。要拿到好的結果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復地試了，當然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結果不容易。