N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（別名甲叉雙丙烯酰胺）Western Blot技術(shù):

一、 原理

與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝#纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。

二、分類N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（別名甲叉雙丙烯酰胺）現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用*種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡(jiǎn)單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。

三、 主要試劑

、 丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫?zé)?/font>（以利于溶解雙丙稀酰胺）的去離子水配制含有29%（w/v）丙稀酰胺和%（w/v）N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲(chǔ)存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺g，加H2O至 00ml。）儲(chǔ)于棕色瓶，4℃避光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。（別名甲叉雙丙烯酰胺）2、 十二烷基硫#鈉SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子水配制，室溫保存。

3、 分離膠緩沖液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合，加水稀釋到00ml終體積。過濾后40℃保存。

4、 濃縮膠緩沖液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml mol/L HCl調(diào)至pH6.8加水稀釋到00ml終體積。過濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用 Tris.CL。

5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化過硫#銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時(shí)，聚合反應(yīng)受到抑制。0%（w/v）過硫#胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數(shù)ml，臨用前配制.

6、 SDS- PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，0%SDS 2.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍(lán).6ml，H2O 32ml混勻備用。按:或:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量00μg。

7、 Tris-甘氨#電泳緩沖液:30.3gTris，88g甘氨#，0gSDS，用蒸餾水溶解至000ml，得0.25mol/L Tris-.92mol/L甘氨#電極緩沖液。臨用前稀釋0倍。

8、 轉(zhuǎn)移緩沖液：配制L轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘氨#、5.8gTris堿、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至總量L。

9、 麗春紅染液儲(chǔ)存液：麗春紅S 2g 三#乙#30g 磺基水楊# 30g 加水至00ml 用時(shí)上述儲(chǔ)存液稀釋0倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。

0、 脫脂奶粉5%（w/v）。

、 NaN3 0.02% 疊氮鈉（有毒，戴手套操作），溶于磷#緩沖鹽溶液（PBS）。

2、 Tris緩沖鹽溶液（TBS）:20mmol/LTris/HCl（pH7.5），500mmol/LnaCl。

3、 Tween20（5）鼠抗人-MMP-9（6）鼠抗人-TIMP-。

4、 過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體。

5、 NBT（溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml）。

6、 BCIP（溶于00%二甲基甲酰胺，50mg/ml）。

7、 00mmol/LTris-HCl（pH9.5）。

8、 00mmol/L NaCl。

9、 50mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mmol/L EDTA。