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柱式血液RNA-DNAout

更新時(shí)間:2013-06-25 點(diǎn)擊量:1241

柱式血液RNA-DNAout
產(chǎn)品及特點(diǎn) 本產(chǎn)品是北京天恩澤在柱式血液RNAOUT(CAT#:7202)基礎(chǔ)上開發(fā)的升級(jí)產(chǎn)品,采用先裂解紅細(xì)胞后純化白細(xì)胞,再?gòu)闹蟹謩e提取總RNA和DNA的策略。本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn):
. 本產(chǎn)品可用于血液RNA提取、血液DNA提取以及DNA和RNA雙提,充分利用寶貴的血液樣品。
2. 無需使用有毒的酚和氯仿,綠色環(huán)保。
3. 采取先裂解紅細(xì)胞的兩步法,避免了血紅素等對(duì)RNA和DNA的污染。
4. RNA直接從白細(xì)胞胞漿中提取,*避免了細(xì)胞核基因組DNA的污染。
5. 純度高,RNA的OD260/280均在2.0左右,DNA的OD260/280均在.8-.9左右
6. 產(chǎn)率高,對(duì)新鮮血液樣品RNA產(chǎn)率一般為5-50 ug/mL,DNA的產(chǎn)率一般在5-8 ug/mL。對(duì)凍存血,RNA和DNA產(chǎn)率跟凍存時(shí)間密切相關(guān),波動(dòng)。
7. 與常用的抗凝劑(包括肝素,EDTA,檸檬酸鈉,草酸鈉)兼容。
8. 得到的RNA可以直接用于RT-PCR和Northern雜交等研究。所得的DNA可直接用于PCR、酶切等實(shí)驗(yàn)。
9. 如果需要提取細(xì)胞核中的RNA前提,或者提取胞漿中線粒體DNA,則不能使用本方法。
規(guī)格及成分 成 份 A型
RNA提取 B型
DNA提取 C型
RNA-DNA雙提
C型紅細(xì)胞裂解液 75 mL 75 mL 75 mL
白細(xì)胞裂解液 5 mL 5 mL 5 mL
核酸上柱液 50 mL 50 mL 00 mL
離心吸附柱 50套 50套 00套
通用洗柱液 50 mL 50 mL 00 mL
RNA洗脫液 0 mL 無 0 mL
DNA洗脫液2.0 無 0 mL 0 mL
使用手冊(cè) 份 份 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸,4℃保存,有效期一年。
自備試劑 RNase-free離心管。
使用方法 一:紅細(xì)胞裂解(請(qǐng)?zhí)崆皩准?xì)胞裂解液放置在冰上預(yù)冷)
. 在.5 mL塑料離心管中,加入0.75 mL新鮮或解凍后的抗凝全血,再加入等體積(0.75 mL)的C型紅細(xì)胞裂解液,輕柔顛倒混勻。
2. 4000-5000 g 4℃離心0分鐘,棄上清(紅色)。
3. 在細(xì)胞沉淀中再加入0.75 mL的C型紅細(xì)胞裂解液,重懸沉淀細(xì)胞(由白細(xì)胞和殘留的紅細(xì)胞組成)。
4. 4000-5000 g 4℃離心0分鐘,棄上清。
5. 在細(xì)胞沉淀中再加入0.3 mL冰上預(yù)冷的的白細(xì)胞裂解液,重懸沉淀細(xì)胞(主要由白細(xì)胞組成)。
6. 冰上放置5分鐘后以裂解白細(xì)胞,8000-0000 g 4℃離心8分鐘,將上清(含RNA的胞漿)轉(zhuǎn)移到RNase-free的塑料管中,立即進(jìn)行RNA提取。沉淀(細(xì)胞核)可暫時(shí)存放在-20℃冰箱,用于后續(xù)基因組DNA提取。

二:RNA提取
. 在約0.3 mL含RNA的胞漿液中加入 mL溶液C,充分震蕩混勻。
2. 室溫放置0分鐘。
3. 將混合液分2次轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。每次轉(zhuǎn)移約0.7 mL,然后室溫2000-5000 g離心半分鐘,棄穿透液,再轉(zhuǎn)移剩下的混合液,再室溫2000-5000 g離心半分鐘,棄穿透液。
4. 加0.7 mL通用洗柱液到離心吸附柱中,2000-5000 g室溫離心半分鐘,棄穿透液。
5. 如果有必要,可以再加0.3 mL通用洗柱液,室溫離心半分鐘,棄穿透液。注意:增加此步可以進(jìn)一步提高RNA的純度。
6. 室溫2000-5000 g離心半分鐘。此步十分重要,否則殘留的通用洗柱液會(huì)影響RNA的后續(xù)反應(yīng)。
7. 將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)RNase-free的收集管(可用.5 mL的RNase-free塑料離心管替代)中,加入50-00 uL RNA洗脫液,室溫放置-2分鐘。
8. 2000-5000 g室溫離心半分鐘,離心管中溶液即為RNA樣品,可以立即用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或存放于-80℃待用。
9. RNA完整性的電泳檢測(cè):如果需要做Northern雜交,強(qiáng)烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行RNA電泳,因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的RNA分子(BioTechniques,28:44,2000)。
0. RNA產(chǎn)量產(chǎn)率測(cè)定:將5-0 μL RNA溶于TE緩沖液中(pH7.5-8.2之間)檢測(cè)其在OD260的光吸收。通過光吸收可以得出RNA濃度( OD260的RNA=40 μg/mL),進(jìn)而計(jì)算出RNA的產(chǎn)量(濃度X體積)和產(chǎn)率(RNA產(chǎn)量/組織用量)。人血RNA產(chǎn)率一般為5-20 ug/mL。
. RNA純度測(cè)定:無污染的總RNA的OD260/OD280一般在2.0左右(具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān)),高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)污染,但一般不影響RT-PCR等反應(yīng)。

三:基因組DNA提取
2. 在白細(xì)胞細(xì)胞核沉淀中加入 mL溶液C,用移液槍充分吹打使溶液不粘稠,否則很難穿過吸附柱。
3. 室溫放置0分鐘。
4. 將混合液分2次轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。每次轉(zhuǎn)移約0.7 mL,然后室溫2000-5000 g離心半分鐘,棄穿透液,再轉(zhuǎn)移剩下的混合液,再室溫2000-5000 g離心半分鐘,棄穿透液。
5. 加0.7 mL通用洗柱液到離心吸附柱中,2000-5000 g室溫離心半分鐘,棄穿透液。
6. 如果有必要,可以再加0.3 mL通用洗柱液,室溫離心半分鐘,棄穿透液。注意:增加此步可以進(jìn)一步提高DNA的純度。
7. 室溫2000-5000 g離心半分鐘。此步十分重要,否則殘留的通用洗柱液會(huì)影響DNA的后續(xù)反應(yīng)。
8. 將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)收集管中(可用.5 mL的塑料離心管替代),加入50-00 uL DNA洗脫液2.0,室溫放置-2分鐘。
9. 2000-5000 g室溫離心半分鐘,離心管中溶液即為基因組DNA。
20. 可以在離心吸附柱中再加入30-50 uL DNA洗脫液2.0洗脫基因組DNA。
2. 匯集2次洗脫的基因組DNA,可以立即用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或存放于-80℃待用。
 

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