ELISA試劑盒的底物
HRP催化過氧化物的氧化反應，代表性的過氧化物為H2O2，其反應式如下：
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經酶作用后成為有色的產物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺（O-phenylenediamine,OPD）、四甲基聯苯胺（3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB）和ABTS[2,2-azino-di-（3-ethylbenziazobine sulfonate-6）]。
OPD氧化后的產物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有zui高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物zui常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。曾有報道OPD有致異變性，操作時應予注意。OPD見光易變質，與過氧化氫混合成底物應用液后更不穩定，須現配置現用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應用液,只需加入OPD后即可作為底物應用液。