豬白細胞介素（IL-）ELISA試劑盒技術分析

ELISA試劑盒實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中豬白細胞介素 (IL-)水平。用純化的豬白細胞
介素 (IL-)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入白細胞介素
(IL-)，再與 HRP 標記的白細胞介素 (IL-)抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，
經過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下
轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的白細胞介素 (IL-)呈正相關。用酶標儀在 450nm
波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中豬白細胞介素 (IL-)濃度。
標本要求
．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能
馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融
2．不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
ELISA試劑盒操作步驟
.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀
釋。
20 ng/L
5 號標準品
50µl 的原倍標準品加入 50µl 標準品稀釋液
60 ng/L
4 號標準品
50µl 的 5 號標準品加入 50µl 標準品稀釋液
30 ng/L
3 號標準品
50µl 的 4 號標準品加入 50µl 標準品稀釋液
5 ng/L
2 號標準品
50µl 的 3 號標準品加入 50µl 標準品稀釋液
7.5 ng/L
號標準品
50µl 的 2 號標準品加入 50µl 標準品稀釋液
2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、
待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣 50µl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40µl，
然后再加待測樣品 0µl（樣品zui終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡
量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3.溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
4.配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此
重復 5 次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶標試劑 50µl，空白孔除外。
7.溫育：操作同 3。
8.洗滌：操作同 5。
9.顯色：每孔先加入顯色劑 A50µl，再加入顯色劑 B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
0 分鐘.
0. 終止：每孔加終止液 50µl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
. 測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止
液后 5 分鐘以內進行。
操作程序總結：
ELISA試劑盒計算
以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的
OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，
即為樣品的實際濃度。
注意事項
．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡 5-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未
用完，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間
控制在 5 分鐘內，如標本數量多，使用排槍加樣。
4．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本 OD 值
大于標準品孔*孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n 倍）后再測定，計
算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
保存條件及有效期
．試劑盒保存：；2-8℃。