細胞培養基純化實驗和包被液的操作過程

　純化實驗操作步驟：

    ．去除培養液；

　　2．×無鈣鎂PBS洗滌；

　　3．加入×EDTA(0×EDTA用PBS稀釋。)37℃孵育5分鐘。

　　4．加入ES培養基使失活；

　　5．將細胞轉入5ml離心管中離心3min；

　　6．去除上清，將細胞重懸于2mlES培養基，至少吹打0－20次。

　　如果加入培養基的量較少會比較容易將細胞團弄散分開。ES細胞有聚集成團的傾向，傳代過程中仔細將細胞弄散分開很重要。這樣可能會減少細胞的自然分化。

　　7．將細胞接種在沒有包被的組織培養皿中（使用和一開始同樣規格的培養皿）放入溫箱2小時（分化細胞在該時間內將黏附，而ES細胞仍將保持懸浮）；

　　8．將含有細胞的培養基轉入明膠包被的組織培養皿。吹打以確保細胞被分散開。

　　9．建議按：4－：0的比率傳代(ATCC)

　　保持細胞的傳代比率很重要，以我們的經驗，：8的比率是好的，可以使細胞的自然分化降到zui低。當你使用不同規格的培養板進行細胞傳代可以使用表來計算傳代比率。

包被液的準備：

　　多聚-L-，5μg/ml

　　把75ml多聚-L-和425ml ×PBS混合。貯存在4℃。

　　纖維結合蛋白，μg/ml

　　把0.5ml纖維結合蛋白和500ml ×PBS混合。

　　包被過程：

　　．加入多聚-L-，至少2－3小時（過夜也行）

　　2．吸出多聚-L-

　　3．加入纖維結合蛋白，大約－2小時

　　4．吸出纖維結合蛋白，放置30分鐘晾干

　　5．貯存在4℃

　　24孔板用200μl，6孔板用500μl。震蕩培養板確保溶液能夠覆蓋蓋玻片或培養基孔。有時需要劇烈震蕩培養板。