① ConA誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)上清（ConA上清）：于24孔培養(yǎng)板孔中加入.25×06/ml鼠脾細(xì)胞和2.5μg ConA，置37℃5%CO2 溫箱培養(yǎng)24～48h，離心收集上清，以CTLL-2或HT-2細(xì)胞檢測其IL-2含量，分裝，置-70℃保存?zhèn)溆谩?/div>
② 繼發(fā)MLC培養(yǎng)上清：取C57BL/6鼠脾細(xì)胞2.5×07 （反應(yīng)細(xì)胞）與等量經(jīng)過照射（2000rad）的DBA/2鼠脾細(xì)胞（刺激細(xì)胞）在20ml培養(yǎng)液中混合，置37℃，5%CO2溫箱培養(yǎng)0～4d，作為原代MLC。離心收集原代MLC細(xì)胞，用培養(yǎng)液洗次。取6×06 原代細(xì)胞與2.5×07 經(jīng)過照射的脾細(xì)胞混合，同上述條件培養(yǎng)36h，收集培養(yǎng)上清，置-70℃保存?zhèn)溆谩＜?xì)胞作為以下試驗(yàn)用的繼發(fā)MLC細(xì)胞。
③ EL-4上清的制備：于24孔板加入06 /ml EL-4鼠淋巴瘤細(xì)胞和20ng PMA，培養(yǎng)4h。收集細(xì)胞，以培養(yǎng)液洗3次，加入培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)36h。收集上清，置-70℃保存?zhèn)溆谩?/div>
操作步驟
. 于96孔培養(yǎng)板孔中加入06 /00μl經(jīng)過照射的同種脾細(xì)胞。
2. 取繼發(fā)MLC細(xì)胞，用含ConA或MLC上清的培養(yǎng)液作有限稀釋至～0個(gè)細(xì)胞/ml，于步驟（）板孔中加入50μl細(xì)胞懸液。培養(yǎng)4d后各孔加入50μl ConA或MLC上清和50μl培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)7～0d。
3. 用5Cr釋放試驗(yàn)測定細(xì)胞毒活性，以篩選同種反應(yīng)CTL與Th。若細(xì)胞毒試驗(yàn)陰性，可以增殖試驗(yàn)測定Th活性。亦可通過IL-2、IL-4的產(chǎn)生或CD4、CD8的表達(dá)進(jìn)行篩選。
4. 鑒定同種反應(yīng)性T細(xì)胞的特征，如細(xì)胞毒活性、增殖反應(yīng)或某些淋巴因子的分泌等。
5. 克隆細(xì)胞的維持:將2.5×04 ～×05 細(xì)胞轉(zhuǎn)種24孔培養(yǎng)板孔中，同時(shí)加入×06 經(jīng)過照射的同種脾細(xì)胞和含條件液的培養(yǎng)液，每周傳代一次。
詳情請看：同種反應(yīng)性Th和CTL克隆的制備
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